Единицы измерения активности и количества фермента
1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.
В практике обычно используют:
Взаиморасчёт этих величин выглядит следующим образом:
1 катал = 1 моль/сек = 60 моль/мин = 60х10 6 мкмоль/мин = 6х10 7 ME
1ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/сек = 1/60 мккатал = 16, 67 нкат
Удельная активность фермента численно ровна количеству единиц активности фермента в биологическом образце (МЕ), делённому на массу (мг) белка в этой ткани. Обычно используется для оценки очистки фермента.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
При определении активности ферментов необходимо создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом. Кроме того необходимо при этом наличие избытка субстрата, чтобы работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.
5. От чего зависит активность ферментов?
Что означает выражение «активность фермента»?
Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов.
Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:
Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:
1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?
Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.
В практике обычно используют:
В настоящее время в основном уже применяются единицы активности – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
Принципы количественного определения активности ферментов
2. Необходимо наличие избытка субстрата, чтобы в течение установленного времени работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).
В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с –1 = 60 моль•мин –1 = 60•10 6 мкмоль•мин –1 = 6•10 7 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин –1 = (1/60) мкмоль•с –1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.
Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.
Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода.
4 Единицы активности ферментов, их применение
Общая активность фермента
Особого внимания исследователя требуют высокие значения активности фермента как в норме, так и в патологии. Рекомендуется работать с небольшими показателями активности фермента. Для этого источник фермента берут в меньшем количестве (сыворотку разводят в несколько раз физиологическим раствором, а для ткани готовят меньший процентный гомогенат). По отношению к ферменту в таком случае создаются условия насыщения субстратом, что способствует проявлению его истинной активности.
Общая активность фермента рассчитывается с помощью формулы:
Следует иметь в виду, что показатели активности ферментов сыворотки крови и мочи, исследуемых в диагностических целях, выражают в единицах общей активности.
Удельная активность фермента
Поскольку ферменты являются белками, важно знать не только общую активность фермента в исследуемом материале, но и ферментативную активность белка, находящегося в данной пробе. За единицу удельной активности принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в единицу времени в расчёте на 1 мг белка пробы. Для вычисления удельной активности фермента необходимо общую активность разделить на содержание белка в пробе:
Например, содержание белка в ткани печени составляет 160 мг/г. Разделив общую активность аланинаминотрансферазы (см. выше) на это значение, получаем 10,4 мкмоль пирувата/мг белка × час.
Чем хуже очищен фермент, тем больше в пробе находится посторонних балластных белков, тем ниже удельная активность. В ходе очистки количество таких белков уменьшается, и соответственно удельная активность фермента повышается. Предположим, в исходном биологическом материале, являющемся источником фермента (измельчённая печень, кашица из растительной ткани), удельная активность была равна 0,5 мкмоль/ (мг белка× мин). После дробного осаждения сульфатом аммония и гель-фильтрации через сефадекс она повысилась до 25 мкмоль/ (мг белка× мин), т.е. увеличилась в 50 раз. К оценке эффективности очистки ферментных препаратов прибегают при производстве лекарственных средств энзиматической природы.
Удельную активность определяют в том случае, когда нужно сопоставить активность разных препаратов одного и того же фермента. Если требуется сравнить активность разных ферментов, рассчитывают молекулярную активность.
