подвижность микробов можно определить
12. Методы определения подвижности бактерий.
Бактерии изучают в живом виде с помощью нативных и окраш препаратов, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли. Окраска живых бактерий: взвесь бактерий вносят в каплю метиленового синего или нейтрального красного. Далее готовят препарат.
Препарат «раздавленная» капля – на центр обезжиренного стекла наносят каплю жидкой бульонной культуры. Затем накладывают покровное стекло, чтобы не было пузырьков воздуха. Капля не должна выступать за стекло. Применяют темнопольное или фазово-контрастное устройство. В центре влажного препарата быстро возникает дефицит О2. Именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.
Иногда бактерии адсорбир-ся на стекле, тогда лучше использовать «висячую» каплю. На покровное стекло наносят каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой (где по краям вазелин) прижимают к покровному. Капля должна быть в лунке. Получается герметичная камера, в кот-й капля не высыхает. Капля должна висеть над лункой. Микроскопируют со стороны покровного стекла (то есть надо резко перевернуть). Опред-е подвижности по Пешкову – бактерии вносят уколом в столбик полужидкого агара – подвижные растут по всей толще среды, неподвижные – по уколу.
При изучении подвижности бактерий надо отличать истинную подвижность от броуновского движения, кот-е явл-ся следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул, выглядит как колебание.
Бактерии двигаются быстро. Уменьшить их скорость можно добавлением метилцеллюлозы, тогда видно движение жгутиков.
13. Структура пептидогликана.
Пептидогликан (муреин) – основа клет/стенки. Состоит из параллельных полисахаридных цепей, представляющих собой череду звеньев N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой к-ты. С каждым остатком N-ацетилмурамовой к-ты связан тетрапептид (из аминок-т). Наличие определённых аминок-т в пептидогликане учитывается в таксономии бактерий. У грам(-) бактерий пептиды в пептидогликане перекрёстно связаны друг с другом. У грам(+) – пептиды связаны через пептидный мостик. След-но, пептидогликан – это гетерополимерное образование, состоящее из гликановых цепей и перекрёстно связанных пептидов.
У грам(+) – пептидогликан многослойный, с ним связаны тейхоевые к-ты. У грам(-) пептидогликан однослойный. Это используется при окраске по Граму.
У грам(-) поверх пептидогликана имеется наружная мембрана (как мозаика). В её составе – фосфолипиды, липопротеиды, белки и ЛПС (липополисахарид). Непосредственно с пептидогликаном ковалентно связан липопротеид (глобулярный слой). Поверх него пластичная мембраноподобная структура из фосфолипидов, ЛПС и белков. Снаружи слой из свободного липопротеида. Всю толщу наруж/ мембраны пронизывают белки, образующие выводные каналы. Они называются белки-порины, так как обеспечивают диффузию разных соединений. Также эти белки явл-ся рецепторами для фагов.
Ф-и: антигенные, токсические (эндотоксин).
14. Принцип окраски по Граму, отличия клет/стенки грам(+) и грам(-) бактерий.
Мазок окрашивают генцианвиолетом через фильтровальную бумагу;
Бумагу удаляют, краску сливают;
Окрашивают мазок р-ром Люголя;
Люголь сливают и наносят 96% спирт на 30-40 сек;
Смывают спирт водой;
Окрашивают водным фуксином;
Промывают водой и сушат.
После Люголя все клетки окраш-ся в фиолетовый цвет. После спирта клетки окраш-ся по-разному: у грам(+) пептидогликан многослойный и краска не вымывается, у грам(-) пептидогликан тонкий и они обесцвеч-ся. При дополнит окраске фуксином грам(-) становятся красного цвета, грам(+) сохраняют фиолетовый цвет.
Отличия клет/стенки: у грам(+) в клет/стенке нет ароматич и серосодержащих аминок-т, мало липидов, у грам(-) – наоборот. У грам(+) есть магниевая соль РНК, у грам(-) – нет. Эта соль образует прочный хим/комплекс с белком, йодом и генцианвиолетом, кот-й не разруш-ся спиртом. У грам(-) такого комплекса нет, они легко обесцвеч-ся под д-ем спирта.
Споры по Граму не окраш-ся, окраска появл-ся только после использования концентрированной подогретой краски. Причём при последующей обработке к-той спора не обесцвеч-ся.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА
Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru
Содержание
Резюме
В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.
В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.
|
Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.
|
Методы определения чувствительности к антибиотикам
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.
Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.
Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.
Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.
Интерпретация результатов определения чувствительности
На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).
Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.
Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.
Чувствительные микроорганизмы (susceptible)
Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.
При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).
Резистентные микроорганизмы (resistant)
К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.
Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)
Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.
С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.
В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.
Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.
В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.
Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий