какое таксономическое значение имеет определение набора ферментов у микроорганизмов
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) СВОЙСТВА И ПРИНЦИПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия.Ознакомить студентов с методами изучения ферментативной активности и принципами идентификации микроорганизмов.
Оборудование и материалы. Засеянные среды Гисса (глюкоза, лактоза, сахароза и т.д.) с признаками кислото- и газообразования, культуры Е. coli на МПБ в пробирках, реактив Эрлиха, культуры В. subtilis на молоке, МПЖ, культуры S. aureus на МПА в пробирках, 3%-й раствор перекиси водорода и другие тесты, результаты определения ферментативной активности культур Е. coli и S. typhimurium на ПБДЭ-пластинах, карточки с описанием свойств отдельных видов бактерий для работы с определителями.
Изучение ферментативной активности микроорганизмов. В пределах семейства у представителей разных родов можно обнаружить как общие для семейства, так и специфические для родов наборы ферментов. У микроорганизмов разных видов в пределах одного рода есть общие (родовые) и специфические для отдельных видов ферменты. Таким образом, каждый вид микроорганизмов характеризуется специфическим набором ферментов, поэтому определение ферментного спектра — важнейший этап идентификации микроорганизмов.
О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизмов воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента регистрируют по изменению физического состояния субстрата (разжижение желатины), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами), образованию определенных продуктов метаболизма (индол, сероводород, аммиак) и т.д.
Наиболее распространены следующие методы регистрации ферментативной активности микроорганизмов.
Выявление сахаролитической активности микроорганизмов. В состав дифференциально-диагностических углеводных сред (среды Гисса — см. тему 7) входят различные соединения, которые можно условно назвать сахарами: моносахариды, полисахариды, многоатомные спирты. При утилизации углеводов в качестве конечных продуктов образуются кислоты и газообразные продукты. Соответственно расщепление углевода регистрируют по изменению рН среды и выделению газообразных продуктов. Закисление питательной среды улавливают при помощи различных индикаторов.
Индикатор BP, входящий в состав сухих сред Гисса, меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.
Индикатор Андрэдэ (кислый фуксин —0,5 г, 1%-й раствор гидроксида натрия — 16 мл, дистиллированная вода — 84 мл) при закислении дает покраснение среды. В жидких средах Гисса образование газов при утилизации субстрата улавливают при помощи поплавков («газовок») — стеклянных трубочек, запаянных в верхнем конце и помещенных в пробирки. В «газовках» скапливаются газы, вытесняющие жидкую питательную среду; в полужидких средах Гисса газообразные продукты остаются в толще среды в виде пузырьков.
Ферментация углеводов иногда происходит медленно, поэтому предварительный учет результатов проводят через 24. 48 ч, а окончательный — через 10. 14 сут инкубирования посевов. Тест с метиловым красным показывает степень закисления среды при расщеплении глюкозы. Метилрот как индикатор срабатывает в диапазоне рН 4,4. 6,0. Исследуемую культуру выращивают 2. 5 сут в жидкой среде Кларка с глюкозой. Затем на 5 мл среды добавляют пять-шесть капель раствора метилрота. Положительный результат — покраснение среды после внесения индикатора (рН 4,0. 5,0).
Среда Кларка: пептон — 5 г, гидрофосфат калия — 5 г, глюкоза — 5 г, вода дистиллированная — 1000 мл. Ингредиенты растворяют в воде, кипятят 2. 3мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9. 7,0, разливают по пробиркам и стерилизуют при 112º С 20 мин.
Тест Фогес-Проскауера выявляет промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкар-бинол, диметилкетон). Исследуемую культуру выращивают на среде Кларка. К 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 5%-го раствора а-нафтола, перемешивают, вносят 0,2 мл 40%-го раствора гидроксида калия и инкубируют 1 ч. Положительная реакция — красное окрашивание среды.
Выявление протеолитических и других ферментов микроорганизмов.Протеолитические ферменты расщепляют белки питательной среды до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов.
Характер роста микроорганизма на молоке: при посеве исследуемой культуры бактерий на стерильное обезжиренное молоко можно выявить фермент, расщепляющий молочный сахар (лактозу), и протеолитические ферменты, действующие на молочный белок (казеин). Расщепление лактозы приводит к закислению и свертыванию молока, при выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется — пептонизируется, в результате чего молоко просветляется, приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок. Свертывание молока может также происходить под влиянием выделяемого некоторыми бактериями «сычужного» фермента, в этом случае реакция молока бывает щелочной. Иногда возможна пептонизация казеина без свертывания молока.
Тест на гидролиз казеина в плотных питательных средах: обезжиренное молоко диализуют для удаления лактозы, которая ингибирует гидролиз казеина. В расплавленный питательный агар с двойной концентрацией агар-агара добавляют равный объем стерилизованного автокла-вированием диализованного молока. Исследуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на поверхность питательной среды, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют до 14 сут. Перед учетом результатов поверхность среды заливают 10%-м раствором соляной кислоты. Положительный результат — просветление среды вокруг колоний.
Тест на желатиназу: культуру микроорганизма засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12 % желатины. После культивирования опытную и контрольную (незасеянную) пробирки охлаждают под холодной водой и по «текучести» желатины делают заключение о наличии фермента.
Тест на сероводород: узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают в 5%-м растворе ацетата свинца, высушивают, стерилизуют. Культуру микроорганизма засевают в питательную среду в пробирке, после чего индикаторную бумагу помещают в пробирку (не должна касаться среды) и закрепляют пробкой. Выделяющийся сероводород реагирует с ацетатом свинца, и образующийся сульфид свинца вызывает почернение бумаги (положительный результат). Описанный метод выявления сероводорода при помощи индикаторных бумажек считают одним из наиболее чувствительных, разработаны и другие методы.
Тест на индол: исследуемую культуру целесообразно выращивать на средах, богатых триптофаном, при расщеплении которого образуется индол (бульон Хоттингера, бульон с 0,1% Z-триптофана). К выращенной культуре добавляют 1. 3мл эфира, встряхивают, отстаивают и вносят 0,5 мл реактива Эрлиха (парадиметиламинобензоальдегид — 1 г, 96%-й этанол — 95 мл, соляная кислота —20 мл). Через 5 мин учитывают результат. Появление на границе эфира и питательной среды красно-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии индола.
Тест на аммиак: исследуемую культуру засевают в жидкую питательную среду в пробирке. Между пробкой и стенкой пробирки закрепляют полоску розовой лакмусовой индикаторной бумажки. Посевы инкубируют в термостате 1. 5сут. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.
Тест на уреазу: исследуемую культуру микроорганизма засевают на среду Кристенсена (пептон — 1 г, хлорид на трия — 5 г, дигидрофосфат калия — 2 г, агар — 20 г, глюкоза — 1 г, 0,2%-й раствор фенолрота — 6 мл, 20%-й раствор мочевины — 100 мл, вода дистиллированная — 1000 мл) и выращивают 1. 4сут. Положительный результат — покраснение среды в результате ее защелачивания.
Тест на редукцию нитратов выявляет восстановление нитратов до нитритов. Культуру микроорганизма засевают в МПБ, содержащий 0,2 % нитрата калия, инкубируют 48. 72 ч, затем в опытную и контрольную пробирки добавляют по 1 мл реактива с крахмалом (растворимый крахмал — 1 г, вода дистиллированная — 100 мл, йодид калия —0,5 г). К этому раствору перед постановкой реакции добавляют несколько капель 10%-го раствора соляной кислоты. Положительный результат— темно-синее окрашивание.
Тест на каталазу: бактериальную массу снимают с поверхности агара бактериологической петлей и суспендируют в капле 3%-го раствора перекиси водорода на предметном стекле. Положительный результат — образование пузырьков газа.
Тест на оксидазу: фильтровальную бумагу пропитывают 1%-м раствором тетраметилпарафенилендиамина дигид-рохлорида. Бактериальную массу петлей наносят на поверхность бумажной полоски. Положительный результат — фиолетовое или пурпурное окрашивание через 10. 60 с.
Тест на редуцирующую способность бактерий (в метиленовом молоке) основан на следующей особенности: при окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются. Такие свойства отмечены у лакмусовой настойки, метиленового синего, малахитового зеленого и т. д. Например, молоко с метиленовым синим готовят так: молоко подщелачивают 10%-м раствором карбоната натрия до рН 7,2 и добавляют 20 мл 1%-го водного раствора метиленового синего на 1000 мл. Готовая среда голубого цвета. Результат учитывают через сутки инкубирования посевов. В случае редукции красителя среда окрашена в кремовый цвет.
Тест-системы для быстрой идентификации бактерий по группе специально отобранных биохимических признаков обычно представляют собой пластмассовые пластины с лунками (микропробирками), заполненными различными сухими средами (субстратами). В эти среды вносят суспензию исследуемой культуры и после инкубирования учитывают результат. К тест-системам прилагают таблицы для учета результатов и идентификации микроорганизмов в зависимости от спектра выявленных ферментов.
За рубежом разработаны тест-системы для идентификации энтеробактерий, анаэробов, несбраживающих бактерий и т. д. В России Нижегородский институт микробиологии и эпидемиологии выпускает тест-систему подобного типа — биохимические пластины для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ), кроме того, разработаны тест-системы для санитарно-микробиологи-ческих целей.
Принципы идентификации микроорганизмов. Основная задача бактериологического диагностического исследования — это определение таксономического положения выделенного микроорганизма путем сравнения его свойств со свойствами известных видов.
В рутинной бактериологической практике микроорганизм идентифицируют, изучая его фенотипические признаки (морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, патогенные). Стали получать распространение некоторые методы идентификации по генотипическим признакам (см. тему 12), которые ранее в основном применяли в научной работе для классификации микроорганизмов с неясным таксономическим положением.
В бактериологии для идентификации используют определители микроорганизмов. Наиболее популярный — определитель бактерий Берджи — включает в себя описание свойств известных видов микроорганизмов. Бактерии в этом руководстве по ограниченному числу морфологических и физиологических признаков объединены в большие группы, например группа № 20 «Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы» или группа № 5 «Факультативно-анаэробные грам-отрицательные палочки». В пределах этих групп при помощи нескольких дифференцирующих признаков бактерии подразделены на семейства, роды и виды. Распределение микроорганизмов в этом определителе не отражает иерархической классификации, а преследует сугубо практическую цель — как можно быстрее и экономичнее установить таксономическое положение изучаемого микроорганизма.
Идентификация неизвестного микроорганизма представляет собой процесс последовательного его отождествления с той или иной большой группой микробов, характеризующихся общими свойствами, затем с семейством в пределах группы, далее с тем или иным родом в пределах установленного семейства, и на конечном этапе исследуемый микроорганизм отождествляют (идентифицируют) по совокупности морфологических, тинкто либо видом в пределах рода. В случае необходимости внутри вида устанавливают принадлежность культуры к био-, серо-, фаговару. Работа с определителем Берджи предполагает использование достаточно большого количества тестов, характеризующих различные свойства микроорганизма. В практических диагностических лабораториях, исходя из эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, обычно проводят бактериологические исследования, заранее ориентированные на обнаружение возбудителя определенной инфекционной болезни, по схеме, предусмотренной официальной инструкцией.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Ознакомиться с тестами, характеризующими ферментативные свойства бактерий (ферментация углеводов в средах Гисса, образование индола, сероводорода; тесты на каталазу, оксидазу, желатиназу и т. д.).
. 2. Используя карточки с описанием свойств бактериальной культуры, при помощи определителя микробов установить ее видовую принадлежность.
3. Оценить результаты изучения ферментативной активности двух бактериальных культур семейства Enterobacteriaceae на ПБДЭ-пластинах и определить их вид при помощи прилагаемой дифференциальной таблицы.
1.Какое таксономическое значение имеет определение набора ферментов у микроорганизмов?
2.Что представляют собой современные тест-системы для изучения ферментативной активности микроорганизмов?
Ферменты микроорганизмов
Enzymes of microorganisms
Термин «фермент» произошел от латинского слова «fermentum», что значит – «закваска».Популярный в настоящее время синоним термина «фермент» – термин «энзим», происходит от греческого слова «enzyme»,что в переводе на русский язык имеет значение «дрожжи» или «закваска».
Содержание:
Простые и сложные белки
Питание и дыхание всех микроорганизмов, в том числе бактерий, как физиолого-биохимические процессы осуществляются благодаря наличию в клетке различных ферментов. Микробные клетки, как и клетки высших организмов, оснащены достаточно активным ферментным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов.
На основании строения ферменты подразделяются на два больших класса: простые белки и сложные белки.
К простым белкам относятся гидролитические ферменты. Второй – более многочисленный класс, объединяет ферменты, управляющие окислением и катализирующие реакции переноса всевозможных химических групп.
Характерным признаком сложных белков является присутствие в строении небелковой группы (кофактора), определяющего активность фермента. Белковая часть сложного белка носит название – апофермент.
По отдельности белковая и небелковая часть таких соединений лишены ферментативной активности и приобретают ее только при соединении. Комплекс апофермента с кофактором носит название – «голофермент».
Классификация ферментов
Название фермента образуется от названия вещества, на которое он оказывает действие или вещества, связанного с природой катализируемой им химической реакции, путем прибавления окончания «- аза». Второй вариант является основой современной классификации и номенклатуры ферментов.
В настоящее время известно более двух тысяч ферментов. Они разделены на шесть классов, каждый из которых в свою очередь делится на соответствующие подклассы и подпод классы. Микроорганизмы, в том числе бактерии, располагают всем набором энзимов (ферментов). В микробной клетке одновременно могут находиться десятки различных ферментов.
Выделяют следующие классы ферментов:
Согласно современной классификации каждому ферменту присваивается шифр из четырех цифр. Первая обозначает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый номер фермента в данном подподклассе.
В частности карбамидамидогидролазе (уреазе) присвоен шифр КФ 3.5.1.5., поскольку она относится к третьему главному классу – гидролазы.
КоА синтетаза имеет шифр КФ 6.2.1.1, что обозначает, что данный фермент относится к шестому классу (лигазы, ко второму подклассу (образование С–связи) и к первому подподклассу (место образования связи в карбоксильной группе), последняя цифра – порядковый номер фермента.
Кроме того, ферменты в зависимости от реакции на условия среды делят на:
По связи с бактериальной клеткой различают:
Функции ферментов
В настоящее время установлено, что ферменты ускоряют химические реакции в организмах, путем понижения свободной энергии активации (количество энергии необходимое для перевода при данной температуре всех молекул одного моля вещества в активное состояние).
Все обменные процессы в клетках микроорганизмов идут с участием ферментов. Они являются биокатализаторами всех химических процессов бактериальной клетки. Данные соединения значительно ускоряют химические реакции. При этом они не расходуются и не входят в состав конечных продуктов.
Ферменты в клетках бактерий присутствуют в незначительных концентрациях, но все они обладают высокими числами оборачиваемости, которые указывают на возможность молекулы фермента катализировать следующие одна за другой реакции тысяч молекул субстрата в минуту.
Установлено, что каждый фермент катализирует только одну реакцию, что обусловливает его специфичность. Обменные процессы микробов протекают с помощью ферментов, набор которых генетически детерминирован и специфичен для каждого вида.
В то же время количество того или иного фермента, содержащееся в бактериальной клетке изменчиво. Приспосабливаемость бактерий к изменяющимся условиям среды обитания сопровождается согласованными изменениями процессов анаболизма и катаболизма. Поскольку регуляция обменных процессов осуществляется с помощью ферментов, то и регуляторные (амфиболические) ферменты воспринимают разнообразные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность. Выделяют три уровня регуляции ферментативных реакций с учетом потребности клеток в энергии:
Абсолютное количество определенного фермента определяется скоростью его синтеза (Ks) и скоростью распада (Kd) по схеме, приведенной на фото 2.
Количество фермента увеличивается за счет возрастания Ksили уменьшения Kd или уменьшается при соответствующем соотношении данных процессов.
Изменение каталитической активности фермента вызывается:
Изменение ферментативной активности микроорганизмов, в том числе бактерий, положено в основу фенотипической идентификации (фенотипические критерии систематики). Для использования спектра ферментов у прокариот используются дифференциально-диагностические питательные среды.
Оптимальные условия действия ферментов
Активность ферментов в большей степени зависит от температуры и величины рН.
Установлено, что оптимальная температура действия ферментов: + 40°C–+ 50°C. Для некоторых +58°C–+60°C. При температуре + 100°Cферменты разрушаются.
Максимальная активность ферментов бактерий, растущих в кислой среде (ацидофилы), наблюдается при рН 4,8. В нейтральной или близкой к нейтральной – при рН 7,2. Однако у бактерий способных расти в широком диапазоне рН, данный показатель практически не влияет на активность ферментов.
Антиоксидантные ферменты бактерий
АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
Гемсодержащие антиоксидантные ферменты (АОФ)
Подробнее об антиоксидантных свойствах бифидо- и пропионовокислых бактрий см. перейдя по кнопке-ссылке:
Информация представленная ниже посвящена антиоксидантным ферментам (АОФ), значительный синтез которых обнаружен у ПКБ. Однако и другие бактерии способны продуцир овать некоторые АОФ, например супероксиддисмутазу (СОД), хотя и не так выраженно, как ПКБ. Тем не менее, наиболее известные пробиотики, лакто- и бифидобактерии, являются (как правило) каталаза-отрицательными бактериями, т.е. в отличие от ПКБ не синтезируют антиоксидантный фермент каталазу (CAT). Тем не менее, лакто- и бифидобактерии, как и ПКБ, являются перспективными источниками безопасных пищевых биоантиоксидантов, т.к. синтезируют другие различные антиоксидантные молекулы, делающие указанные микроорганизмы потенциальными терапевтическими агентами для благотворного воздействия на здоровье хозяина путем защиты от оксидативного стресса. Подробнее об этом см. по выше указанной кнопке-ссылке.
СУПЕРАНТИОКСИДАНТЫ
Многие заболевания, начиная от нейродегенеративных и заканчивая некоторыми типами рака, связаны с окислительным стрессом, когда процесс синтеза активных форм кислорода выходит из-под контроля. Введение антиоксидантов может способствовать уменьшению токсичного воздействия радикалов.
Антиоксидантная ферментная система
Как и у животных, пробиотики также имеют свои собственные антиоксидантные ферментативные системы. Одним из наиболее известных из этих ферментов является супероксиддисмутаза (СОД или SOD). Супероксид является одним из наиболее распространенных АФК, вырабатываемых митохондриями, в то время как СОД катализирует расщепление супероксида на перекись водорода и воду и, следовательно, является центральным регулятором уровня АФК. Все СОД являются металлопротеинами : бактерии могут использовать Fe-SOD (как ПКБ) и Mn-SOD, но млекопитающие используют как цитоплазматические, так и внеклеточные формы Cu, Zn SOD и митохондриальные Mn-SOD, которые в эволюционном отношении тесно связаны с бактериальными Mn-SOD. В исследовании Kullisaar с коллегами Lactobacillus fermentum E-3 и E-18 смогли экспрессировать Mn-SOD, чтобы противостоять окислительному стрессу [Kullisaar T., et al. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Food Microbial. 2002, 72, 215–224]. Хотя антиоксидантная активность СОД хорошо известна, терапевтическое применение СОД ограничено, главным образом из-за его короткого периода полувыведения из кровообращения, что ограничивает его биодоступность. Для решения этой проблемы были предприняты попытки найти подходящие транспортные средства для СОД. Пробиотические бактерии, способные к локальной доставке СОД, открывают новый подход к заболеваниям, характеризующимся продуцированием АФК.
Лактобациллы, как и бифидобактерии обычно являются CAT-отрицательными [см.: Spyropoulos, B.G., et. al. Antioxidant properties of probiotics and their protective effects in the pathogenesis of radiation-induced enteritis and colitis. Dig. Dis. Sci. 2011, 56, 285–294].
Итак, ранее мы уже отмечали, что в отличие от других пробиотических микроорганизмов у пропионовокислых бактерий установлен значительный (!) синтез гемсодержащих (см. гем ) антиоксидантных ферментов каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (СОД). Стоит сказать, что в отличие от низкомолекулярных антиоксидантов, которые могут связать ограниченное число (как правило, одну) молекул радикалов, антиоксидантные ферменты могут нейтрализовать активные формы кислорода одну за другой, а потому являются своеобразными суперантиоксидантами.
кратко о защите ДНК от свободных радикалов
Некоторые микроорганизмы симбионтной микрофлоры, участвущие в биосинтезе антиоксидантных ферментов, нейтрализуют свободные радикалы и тем самым помогают нам устранить причины р азрушения ДНК, провоцирующие мутагенез и замедлить процессы старения.
Таким образом, система ДНК-репарации направлена не на нейтрализацию свободных радикалов, а на устранение их эффектов на молекуле ДНК. Разумеется, действие антиоксидантных ферментов, связывающих свободные радикалы, препятствует повреждению молекулы ДНК.
ФЕРМЕНТЫ: КАТАЛАЗА, ПЕРОКСИДАЗЫ и СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА (СОД)
Каждая клетка человеческого организма обладает собственной антиоксидантной защитой. Основным фактором, ограничивающим разрушающее влияние свободных радикалов в организме, являются 2 антиоксидантные системы: ферментативная (антиоксиданты: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза) и неферментативная (антиоксиданты: аскорбат, токоферол, глутатион и др.).
Синтезируемые пропионовокислыми бактериями антиоксидантные (прокариотические) ферменты, супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза, также как и одноименные (эукариотиические) антиокислительные ферменты человеческого организма, образуют антиоксидантную пару, которая борется со свободными радикалами кислорода, не давая им возможности запустить процессы цепного окисления.
РОЛЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ (СОД) В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА
Супероксиддисмутаза или СОД является одним из четырех природных ферментных антиоксидантов, которые вырабатываются естественно в организме человека, и действие которых направлено на то, чтобы уменьшить ущерб, наносимый свободными радикалами. В дополнение к супероксиддисмутазe (СОД) к группе ферментных антиоксидантов относятся каталазa (KAT), пероксидазы (в частности, глутатионпероксидаза (ГП)) и глутатионредуктаза (ГР). Эта группа антиоксидантов отличается от других антиоксидантов, которые классифицируются как неферментные.
ИСТОЧНИКИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ
Пагубное действие на организм многих радиационных излучений и многих химических мутагенов связано с возникновением свободных радикалов. (Дубинин, 1976; Petkau, 1987; Порошенко, Абилев, 1988). Потенциальными биологическими мишенями для радикальной атаки служат липиды, белки, нуклеиновые кислоты. Свободные радикалы часто вовлекаются в активацию многих типов прокарциногенов и промутагенов, превращая их в карциногены и мутагены и связывая эти активированные формы с ДНК (Pryor, 1986). Пероксидный радикал может вызывать повреждения ДНК, а система, продуцирующая супероксидные радикалы, провоцирует возникновение гидроксильных радикалов (и опасный синглетный кислород), образующих радикальные сайты на ДНК. Лучевая болезнь, многие формы рака и ряд других тяжелых заболеваний связаны прямо или косвенно с образованием радикалов. Свободные радикалы содержатся в сигаретном дыме (Pryor, 1985), являющимся опухолеродным агентом.
И в слюне и в человеческой сыворотке содержится супероксиддисмутаза (СОД), пероксидаза и каталаза – антиокислители (ферменты), снижающие уровень H2O2 (перекиси водорода) и O2 и представляющие собой одну из форм естественной защиты организма от действия мутагенных факторов (Nishioka, Nunoshiba, 1986). Клинические исследования показали, что СОД оказывает высокий положительный эффект при лечении сердечных приступов, связанных с повреждением сердечной мышцы (Fass, 1988). СОД имеет перспективы применения не только в медицине, но и в пищевой промышленности, где в сочетании с каталазой и пероксидазой может использоваться для предотвращения окисления липидов и других ценных компонентов пищи (Taylor, Richardson, 1974).
Таблица 1. Классификация и распределение СОД.
СОД (SOD) можно разделить на 2 группы по структуре : Cu/Zn-SOD первая группа, и Mn-SOD и Fe-SOD вторая группа. Естественно возникающие SOD имеют различные ионы активного центра, но каталитически активные места имеют высокую степень структурной идентичности и эволюционной консервации, т.е. ионы активного центра представляют собой тетрагональную пирамиду или тетраэдр, состоящий из 3 или 4 молекул гистидина (His), имидазолила и 1 H 2 O.
Интересное дополнение по поводу бактериальных СОД
Анаэробные, но аэротолерантнные бактерии Propionibacterium freudenreichii sp. shermanii содержат одну супероксиддисмутазу, проявляющую сравнимую активность с железом или марганцем в качестве кофактора металла. Образование супероксиддисмутазы не зависит от добавки железа или марганца в питательную среду. Даже в отсутствие этих металлов белок строится в сопоставимых количествах. Бактерии, выращенные в отсутствие железа и марганца, синтезируют супероксиддисмутазу с очень низкой активностью, в состав которой входит медь. Если среда также не содержала меди, в нее включали кобальт, что приводило к ферментативно неактивной форме. В отсутствие кобальта была создана ферментативно неактивная супероксиддисмутаза с неизвестным содержанием металлов. После аэрации количество супероксиддисмутазной активности непрерывно увеличивалось до 9 ч благодаря синтезу белка de novo. Эта супероксиддисмутаза включила железо в активный центр. Супероксиддисмутаза Propionibacterium shermanii способна образовывать гораздо более широкий спектр комплексов с ионами микроэлементов in vivo, чем это было признано ранее, что позволяет предположить, что первоначальной функцией этих белков было связывание цитоплазматических микроэлементов, присутствующих в избытке.
Также бактерии, которые выработали СОД, проявляющие активность только с железом или марганцем, могут инкорпорировать другой металл in vivo, если нативный металл недоступен. Это было тщательно изучено в Escherichia coli, имеющей конститутивный Fe-SOD и индуцибельный Mn-SOD. Несмотря на высокое структурное сходство и сравнимые каталитические константы, гены Mn- и Fe-SOD по-разному реагируют на сигналы окружающей среды. Транскрипция Mn-SOD регулируется не только кислородом или окислительно-восстановительными препаратами, но и железом сложным образом. Напротив, активность Fe-SOD не отвечает ни на один из этих факторов. Поэтому Fe-SOD обычно считается конститутивным, а Mn-SOD индуцибельным, особенно в отношении окислительного стресса.
Со времени открытия СОД у анаэробных бактерий в сопоставимых количествах с аэробными организмами (у анаэробных Methanobacterium bryantii СОД достигает до 0,4%], а у P. shermanii до более чем 1% цитоплазматических белков) возникли сомнения по поводу ферментативной функции СОД и возникли вопросы о другой «активности». Наблюдение, что СОД P. shermanii включает множество металлов in vivo, предполагает гипотезу, что этот белок первоначально функционировал, чтобы сформировать комплексы с избытком следовых металлов, которые были токсичны для организмов. Это все еще может быть причиной, по которой СОД синтезируется анаэробными бактериями. С увеличением концентрации кислорода в окружающей среде дисмутация супероксидных радикалов, вероятно, стала основной функцией в аэробных организмах.
Признаки дефицита СОД в организме:
Существенная роль отводится супероксидным радикалам в развитии воспалительных и других хронических заболеваний. Результатом исследования этих процессов явилось использование СОД в качестве противовоспалительного средства (орготеин, пероксинорм), а также применение в составе др. антиоксидантных препаратов (см. рис.):
Эти дополнительные свободные радикалы наносят ущерб окружающей ткани и на протяжении многих лет вызывают её постепенные физиологические изменения, в результате которых появляются видимые признаки старения. Для оказания помощи в нейтрализации активных форм кислорода в клетках, человеческий организм разработал ферментативную антиоксидантную систему, состоящую из четырех ферментов, перечисленных выше.
Прим.: Исследования, проведенные на дрозофилах (плодовые мушки), показали, что повышение уровня супероксиддисмутазы СОД может замедлить процесс старения. Когда генетические характеристики плодовых мух были изменены и уровни СОД повышены, средняя продолжительность жизни мух увеличилась до 40%.
Итак, СОД является эндогенным акцептором свободных кислородных радикалов, избыточное накопление которых в клетке имеет значение в развитии целого ряда кислород зависимых патологических процессов (гипоксия, воспаление, интоксикация и др.) СОД удаляет супероксидные радикалы и предотвращает образование других, более опасных для организма свободных радикалов: гидроксильного радикала и синглетного кислорода. Кроме того, СОД предотвращает накопление в очаге воспаления нейтрофилов, которые секретируют значительные количества лизосомальных ферментов, разрушающих близлежащие ткани. Очевидно, что лекарственные препараты на основе СОД являются наиболее перспективными среди противовоспалительных препаратов.
Кроме общебиологического значения данного фермента, связанного с основополагающей ролью эндогенного антиоксиданта, пристальное внимание к данному белку привлечено в связи с его высокой лекарственной эффективностью. СОД воздействует на ключевые этапы заболеваний различной природы (вирусные и бактериальные инфекции, аутоиммунные заболевания, болезни ЦНС, радиационные поражения и др.), что определяет перспективность применения препаратов на основе СОД в ревматологии, кардиологии, офтальмологии, гастроэнтерологии и т.д.
РАБОТА ФЕРМЕНТНОЙ ЗАЩИТЫ
Итак, передовой линией защиты от токсического действия производных O2 являются ферменты: супероксиддисмутаза, захватывающая молекулы O2 – , каталаза и пероксидаза, улавливающие H2O2. Они сводят до минимума концентрацию в клетке O2 – и H2O2 и не дают им возможности взаимодействовать с образованием гидроксильного радикала ОН*, превосходящего супероксидный радикал O2 – по окислительной активности и токсичности.
Источником возникновения О Н * могут служить также реакции одноэлектронного окисления перекиси водорода, катализируемые железосодержащими соединениями, всегда имеющимися в клетках:
Иными словами, избыточное накопление перекиси водорода Н2О2 очень токсично, особенно для нефагоцитирующих клеток. Накопление пероксидов и генерация свободных радикалов может приводить к повреждению мембран (рак, атеросклероз).
Т.е. для предотвращения повреждающего действия пероксидов служат две ферментативные системы:
Простетической группой пероксидаз (т.е. небелковым и не производным от аминокислот компонентом, ковалентно связанным с белком) является протогем, т.е. п ероксидазы — сложные белки-гемопротеиды, активным центром которых является железо гема. Ферменты этого типа широко представлены у растений, а также встречаются в молоке, лейкоцитах, тромбоцитах и тканях, продуцирующих эйкозаноиды.
Пероксидазы найдены в тканях человека и животных, в бактериях и растениях. Субстратами пероксидаз служат полифенолы, ароматические амины, аскорбиновая кислота и т. д., а донаторами кислорода, наряду с Н2O2, могут быть органические перекиси.
Эта реакция напоминает пероксидазную, только вместо RH2 используется Н2О2. Каталазу находят в крови, костном мозге, слизистых оболочках, печени, почках, т.е. в клетках, где происходит интенсивное окисление с образованием Н2О2.
Поскольку перекись водорода H2O2, также является радикалом и оказывает повреждающее действие, в клетке происходит ее постоянная инактивация ферментом каталазой. Каталаза катализирует расщепление перекиси водорода H2O2 до молекул воды и кислорода и может разложить 44 000 молекул H2O2 в секунду.
Биологическое значение Каталазы заключается именно в разложении перекиси водорода, которая образуется в клетках при воздействии ряда флавопротеиновых оксидаз, чем обеспечивается действенная защита клеточных структур от разрушения, которое осуществляет перекись водорода. Если вследствие генетических причин возникает дефицит Каталазы развивается акаталазия. Это наследственная болезнь, клиническими проявлениями которой являются изъязвления слизистой носа и полости рта, а в некоторых случаях явно выраженные выпадение зубов и атрофические изменения альвеолярных перегородок.
Таким образом, ферменты каталаза и пероксидаза в сочетании с СОД создают клеткам антиокислительную защиту
Каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза (СОД), система ДНК-репарации, а также различные субстраты, участвующие в нейтрализации свободных радикалов, составляют антиоксидантную ферментную систему микроорганизмов
На основании изложенного можно сделать вывод, что антиоксидантная ферментная система дружественных нам бактерий также играет огромную роль в защите клеток нашего организма от постоянных и многочисленных атак свободными радикалами кислорода. Антиоксидантные ферменты (АОФ) микроорганизмов, препятствуя запуску процессов цепного окисления, предотвращают в т.ч. и процессы разрушения ДНК свободными радикалами, которые в свою очередь провоцируют процессы мутации (мутагенез).
ОТСУТСТВИЕ КАТАЛАЗЫ У МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Отсутствие каталазы у молочнокислых бактерий связано с тем, что они не могут синтезировать гем — простетическую группу фермента, но способны к синтезу апофермента. При добавлении гемовых групп извне молочнокислые бактерии образуют гемсодержащую каталазу. У ряда молочнокислых бактерий обнаружена каталаза, не содержащая гемовой группы, названная поэтому псевдокаталазой. Выделенный фермент состоит из шести идентичных полипептидных цепей, соединенных между собой нековалентными силами. Каждая субъединица содержит 1 атом марганца.
Прим.: Перекись водорода, возникающая в результате взаимодействия клеток с O2, устраняется и неферментативными путями. Известно, что ионы Fe 2+ в водном растворе ускоряют восстановление H2O2 до H2O. В клетке всегда содержится некоторое количество ионов железа. Разрушение H2O2 может происходить и за счет выделяющихся в культуральную среду восстановленных веществ.
Резкое возрастание масштабов взаимодействия прокариот с O2 при функционировании метаболизма аэробного типа делает неэффективными неферментативные пути устранения H2O2. Для разложения перекиси водорода, образующейся в больших количествах, необходимы ферменты, повышающие скорость разложения H2O2 на несколько порядков. Это обеспечивается каталазой и пероксидазой. Таким образом, в условиях активного взаимодействия клеток с O2, делающего возможным аэробную жизнь, система ферментной защиты от его токсических эффектов сформирована с участием супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы в качестве необходимых компонентов.
Основные позитивные воздействия СОД (Супероксиддисмутазы) на системы человеческого организма
Антиоксидантное; регенерирующее; ранозаживляющее; противоаллергическое; противовоспалительное; антиатерогенное; противоожоговое; геропротекторное; радиопротекторное; кардиопротекторное; онкопротекторное; антитоксическое; антивирусное; поддержка функции половых желез.
Защита от преждевременного старения: длительность жизни человека тесно связана с концентрацией СОД в теле и органах.
Защита кожного покрова:
Сохранение волос:
Использование СОД полезно при:
профилактике старения организма; профилактике рака; воспалительных процессах (альтернатива кортикостероидам); снижении АД; снижении уровня липидов и сахара в крови; миокардиальной ишемии; сахарном диабете; эмфиземе легких; респираторных инфекциях; пневмонии; гепатопатии; нефропатии; цистите; воспалении толстого кишечника; проктите; ожогах; дерматомиозитах; механических травмах глаз; ожогах роговиц; дистрофии роговицы различного генеза; инфекционных кератитах (в составе комплексной терапии); первичной глаукоме (в составе комплексной терапии); предотвращении повреждений при радиационной терапии; остеоартрите; ревматическом артрите; бурсите; красной волчанке; обработке сигарет для уменьшения содержания нефтяных смол и никотина.
Будьте здоровы!
ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ