Фибропластика лица что это

Что такое фибробласты и почему на них стоит обратить внимание

Фибробласты — особые клетки кожи, поддерживающие ее молодость. С годами их количество уменьшается почти на 40% — это одна из причин ухудшения состояния кожи. Повлиять на ситуацию может SPRS-терапия — антивозрастная методика, основанная на действии фибробластов.

Лусине КАРАПЕТЯН, заведующая косметологическим отделением
Эстетической клиники ЕМС

Что такое SPRS-терапия

Как получить фибробласты

Далее образец отправляют в лабораторию, где проводят диагностику фибробластов, оценку функциональной активности клеток и их способности к делению. Отбирают лучшие клетки с высоким потенциалом и затем наступает этап выращивания фибробластов, который длится шесть недель.

SPRS-терапия

Выполняют инъекции по типу мезотерапии — микродозами на небольшую глубину и небольшое расстояние между точками вкола. Кожу предварительно обрабатывают анестетиком. В среднем курс состоит из двух процедур с интервалом в месяц-полтора. Однако каждому пациенту дают индивидуальные рекомендации, так как все зависит от уровня дефицита фибробластов в каждом конкретном случае и их способности к делению. Затем можно выполнять поддерживающую терапию раз в несколько лет. Все это время клетки можно хранить в криобанке.

Эффективность

Особенность

Показания

Надо отметить, что SPRS-терапия — весьма дорогостоящая, но эффективная процедура, которая, по утверждению специалистов, позволит выглядеть на 10-15 лет моложе без операций и реабилитаций.

Стоимость SPRS-терапии составляется из открытия собственного банка фибробластов, забора образца для выращивания фибробластов, введения фибробластов (цена определяется их количеством) и хранения материала в криобанке для последующих инъекций. В сумме стоимость может достигать 1 млн рублей и выше.

Имеет значение: 5 вопросов о коррекции губ

Скорректировать форму и объем губ позволяют инъекции филлеров, в основе которых, как правило, содержится гиалуроновая кислота различной плотности. Не вредна ли она при частом применении и что еще нужно знать о популярной процедуре, узнаем у специалиста.

Евгения Иконникова, врач-дерматокосметолог «Института пластической хирургии и косметологии», кандидат медицинских наук

1. Выводится ли полностью гиалуроновая кислота

Гиалуроновая кислота – естественное вещество, которое содержится во многих тканях организма человека, включая кожу. Также в тканях присутствует специальный фермент (гиалуронидаза), который ее своевременно разрушает. Если введенные филлеры являются качественными и содержат высокоочищенную гиалуроновую кислоту, они со временем естественным образом разрушаются и полностью удаляются из тканей. Это значит, что все наполнители являются временными. Именно это определяет сроки повторной коррекции, которые в среднем составляют от восьми месяцев до двух лет.

Если филлеры некачественные, несертифицированные, то они могут находиться в тканях организма гораздо более длительное время, порой приводя к серьезным проблемам не только с эстетической точки зрения, но и в плане здоровья. Плюс ко всему в таких некачественных наполнителях зачастую содержится не только гиалуроновая кислота, но и различные вредные примеси. Они также могут влиять на скорость растворения препарата и на его совместимость с тканями организма. Такие филлеры нередко приводят к воспалению: вокруг его очага формируется капсула, которая дополнительно затрудняет разрушение филлера. Также сроки вывода наполнителя зависят от степени сшивки между молекулами гиалуроновой кислоты (проще говоря, от плотности препарата), а также от анатомических и физиологических особенностей зоны введения.

2. Не нарушатся ли естественные контуры губ, если часто применять филлеры

Немаловажным фактором появления «размытости» контура является определенная форма губ (излишне тонкие, напряженные «мускульные», губы в виде «крыльев чайки»). В этих случаях для сохранения естественности следует использовать минимальный объем филлера или отказаться от коррекции. Компромиссом может быть использование «мягких» филлеров, которые придадут губам лишь легкую припухлость, но не будут влиять на их форму.

На снижение четкости формы губ могут влиять и слишком часто проводимые коррекции: постоянная травматизация нарушает целостность границы тканей в области перехода красной каймы в кожную часть и препарат может частично мигрировать выше.

3. Можно ли сделать любую желаемую форму губ

Да, действительно многие приходят на прием с уже выбранными фотографиями тех губ, которые хочется получить после инъекции филлеров, но удовлетворить подобный запрос можно далеко не всегда. Есть определенные формы губ, которые с трудом поддаются коррекции (например, с минимальным запасом объема тканей или с гиперактивностью круговой мышцы рта). Также не стоит забывать об индивидуальных пропорциях и эстетической уместности. Ведь всем хочется выглядеть естественно и гармонично. Но во многих случаях исходные данные поддаются коррекции и по объему, и по форме, в том числе решаются проблемы асимметрии. Все возможности и реальные перспективы должен определять врач непосредственно на приеме. Он поможет правильно настроить ожидания пациента для избежания разочарования от процедуры.

4. Не провоцируют ли инъекции в губы появление герпеса

Любая травматичная процедура в области лица может спровоцировать рецидив герпесвирусной инфекции, особенно на фоне сниженного иммунитета. Поэтому если у вас периодически возникают герпетические высыпания, необходимо обязательно заранее, еще до процедуры, сообщить об этом врачу. В таком случае вам будет назначен прием противовирусного препарата для предупреждения развития подобного неприятного осложнения.

5. Почему в анфас увеличенные губы иногда смотрятся лучше, чем в профиль

Объем и вертикальная высота верхней и нижней губы должны вписываться в пропорции золотого сечения и при этом выглядеть максимально естественно. Если смотреть на лицо в анфас, то идеальное соотношение верхней и нижней губы составляет 1:1,6. Если в боковой проекции, то по отношению к прямой линии, проведенной от основания носа к выступающей части подбородка (линия Риккетса), верхняя губа должна выступать на 3,5 мм кпереди от линии, нижняя – на 2,2 мм. Искажение этих пропорций, их неправильное соотношение и приводит к появлению формы «утиных губ».

При коррекции важно помнить, что рот не должен полностью перетягивать внимание на себя и агрессивно доминировать над остальными чертами лица, делая его карикатурным.

Нередко на приеме пациенты просят провести чрезмерное увеличение объема губ или только одной из них, не учитывая баланс между ними. Поэтому в подобных случаях врач должен подробно рассказывать о понятии идеального баланса и гармонии лица. Но такие случаи, к счастью, случаются все реже.

Источник

Что такое плазмолифтинг

Статья опубликована: с 19.11.2015

Что такое плазмолифтинг

Механизм действия плазмолифтинга

Для использования такого способа регенерации клеток необходима тромбоцитарная аутоплазма (ТАП). Она не имеет эритроцитов в составе, а число тромбоцитов в ней близко к их количеству в периферической крови (150-350 тыс./мкл). Такая плазма очень богата на содержание аминокислот, минеральных элементов (калий, магний, цинк, железо, кальций и др., пептидов и витаминов группы В, С, A, D, E, K, необходимых для жизнедеятельности клеток. Являясь естественным компонентом человеческого организма, аутоплазма не вызывает аллергических реакций. Этот метод является универсальным ещё и благодаря своей биологической доступности за счет чего процессы регенерации идут естественным образом.

Физиологически процесс плазмолифтинга происходит следующим образом: когда тромбоциты теряют контакт с эндотелием выходя из капилляров и сосудов, они меняют свою форму и выделяют альфа-гранулы, которые насыщают поврежденное место факторами роста.

Тоже самое происходит и процедуре плазмолифтинга, когда аутоплазму вводят в нужную область, т. е. происходит адгезия тромбоцитов и высвобождение факторов роста из альфа гранул, как и при нормальным защитным физиологическим процессом.

Как проходит процедура плазмолифтинга

Взятая у пациента кровь подвергается процедуре центрифугирования для отделения из неё эритроцитов. Тромбоцитарная аутоплазма должна быть желтого цвета. Через 10-15 минут готовую тромбоцитарную аутоплазму уже можно использовать в виде инъекции в требуемый лечения участок. Перед этим кожа обрабатывается специальным анестезирующим кремом. Берется тонкая игла и папульным методом вводится препарат.

Курс лечения методом плазмолифтинга назначается индивидуально, исходя от первоначального состояния и степени повреждения клеток. В среднем рекомендуется 3-4-5 процедур с интервалом около недели – такой курс производит заметный эффект. Для поддержания улучшенного состояния клеток можно повторять процедуру один раз в год или два.

Показания к плазмолифтингу

В косметологии использование плазмолифтинга целесообразно в следующих случаях:

Конечно, использование аутоплазмы в косметологии не ограничено только лицом и волосистой частью головы, данные причины являются лишь основными. Метод используется на любом участке тела человека, имеющем дефекты. Плазмолифтинг тела является востребованной процедурой. Его применяют локально для лечения целлюлита и ожирения и омоложения кожи тела.

Противопоказания для плазмолифтинга

Несмотря на максимальную естественность данного метода и наибольшую близость аутоплазмы к составляющим крови определенного человека, косметическая процедура плазмолифтинга имеет определенный ряд противопоказаний. Среди них можно назвать:

При этом плазмолифтинг имеет минимальный риск возникновения осложнений и побочных эффектов, ведь при данном методе в организм не вводится никаких чужеродных веществ. В этом состоит его главное отличие от процедур биоревитализации и мезотерапии.

Индивидуальный эффект от применения данного метода обусловлен зависимостью от первоначального состояния клеток. Плазмолифтинг привлекателен в первую очередь своей простотой и естественностью, а также минимальным риском побочных действий. Кожа при этом не травмируется. Что лучше биоревитализация. мезотерапия или плазмолифтинг для каждого конкретного пациента может определить только косметолог.

Эффект от плазмолифтинга

Большинство пациентов отмечают заметный положительный эффект через 1-1,5 недели. Некоторые отмечают, что эффективность плазмолифтинга наступает уже после первой инъекции. Результат зависит от возраста, состояния кожи и особенностей организма в целом.

Среди испытавших метод плазмолифтинга на себе большинство оставляют о процедуре хорошие отзывы, которые помогут сформировать отношение к такому способу у новых пациентов. Многие женщины отмечают в качестве результата процедуры омоложение кожи, более свежий её вид, постепенное сглаживание рубцов и снижение последствий акне. Кожа становится более эластичной и подтянутой.

Омолаживающий эффект. Помогает удалить омертвевшие клетки, способствуя образованию новых, разглаживает кожу, повышая её тургор, кожа становится нежной и мягкой на ощупь. Активизирует ген BCL-2 задерживающий старение клеток.

Защитный эффект. Усиливает защитный барьер против воздействия вредного ультрафиолета, улучшает регенерацию кожи, благодаря чему быстрее затягиваются мелкие ранки и рубцы. Кожа становится защищенной от воздействия всевозможных внешних факторов, оказывающих негативное влияние на её состояние: перепады температур, солнечный свет, последствия от приема сильных лекарственных препаратов. Подавляет размножение патогенной микрофлоры.

Увлажняющий эффект. Предотвращает обезвоженность кожи. Происходит глубокое увлажнение кожи и улучшается синтез макромолекулярных белков, которые обеспечивают эластичность кожи. Клетки кожи удерживают больше влаги внутри, благодаря чему устраняется ощущение стянутости, сухости, уменьшается проявления раздражения и воспаления кожи.

Уменьшает фоточувствительность кожи. Внешний вид улучшается благодаря усилению метаболизма клеток, за счет чего предотвращается появление пигментных пятен после инсоляции, что приводит к выравниванию цвета лица.

Улучшает трофику кожи. Усиливается процесс кровообращения в дерме, ускоряются метаболические процессы, что приводит к обновлению клеток, кожа приобретает здоровый и свежий вид.

Источник

В борьбе за красоту и молодость стоит узнать, что такое брыли, от чего появляются эти несовершенства, как убрать их и подтянуть овал лица у женщин в домашних условиях или салоне: в статье мы разберем фото примеров до и после проведения процедур, чем они эффективны и как быстро избавиться от дефекта. Ведь, если не принять меры, очень скоро опущение кожных покровов добавит несколько лишних лет к визуальному образу.

Определение

Уменьшение тургора приводит к тому, что кожа начинает обвисать в нижней части щек, формируя неестественной, неправильный овал лица. Выглядит это совсем не эстетично, указывая не только на возрастные изменения, но и на многие пагубные привычки, а также отсутствие своевременного и эффективного ухода.

От чего появляются брыли

Это только основные факторы, не считая негативного воздействия окружающей среды, аллергических реакций на косметику и химические вещества и другие процессы, способные нарушить естественные механизмы биологической работы клеток кожи, приводящих к потере тургора.

Исправление ситуации при помощи косметологов

Самыми эффективными консервативными методиками устранения данного дефекта является посещение косметологического кабинета. Врач сможет определить первопричину, степень запущенности проблемы, а также выбрать комплекс процедур, которые помогут в борьбе за красоту и молодость кожи. Среди существующих средств:

При совокупности всех этих подходов можно добиться не только визуального уменьшения недостатка, но и полностью убрать его или значительно замедлить провисание. Все методы должны быть направлены на то, чтобы улучшить тургор, стимулировать собственный синтез коллагена и эластина в тканях, уменьшить количество поврежденных неработоспособных клеток, их обновление.

Как убрать брыли на лице в домашних условиях

Дома справиться с такой проблемой достаточно сложно. Все методики можно отнести скорее к профилактическим, чем к дающим ощутимый результат.

Самый действенный способ может быть только в случае, если человек имеет избыточную массу тела. При правильном похудении жир уйдет со щек, а кожа при дополнительном уходе быстро подтянется и создаст гармоничный овал лица. Однако нельзя допускать резкого снижения веса, которое только сильнее усугубит проблему. Оптимальный вариант — потеря 4-5 кг в месяц под строгим контролем диетолога и эндокринолога.

Если проблема еще не зашла далеко и лишь начинает проявляться, используйте в качестве корректировки или предупреждения массажи, маски, упражнения.

Можно ли бороться с брылями консервативными методами

Единственный действенный способ — это пластическая операция, нити и другие вмешательства, которые полностью устранят нежелательный дефект. Все остальные варианты помогут в случаях, когда недостатки только начали образовываться. Они позволят немного подтянуть овал, и не допустить быстрого прогрессирования обвисания кожи.

Если изменения критичны, то вернуть тургор помогут лишь оперативные способы. В дальнейшем можно использовать консервативные для продления эффекта. При недостаточном уходе даже после пластической операции проблема может вновь вернуться, что потребует уже более дорогостоящих и кардинальных вмешательств для возвращения красоты и молодости.

Массаж от брылей

Достаточно эффективное средство. После нанесения косметики следует выполнять движения специальными массажными валиками или руками по направлению от подбородка, в стороны и вверх к ушам. Массирование также можно проводить мягким полотенцем, смоченным в соляном растворе. После окончания соль обязательно смывается, а на кожу наносится увлажняющий или антивозрастной крем.

Убираем брыли на лице лифтинговыми масками

Подойдут как аптечные, так и домашние рецепты. В случае народных средств помогут алоэ, мед, эфирные масла апельсина, кедра, чайного дерева, арганы. Среди магазинных продуктов стоит выбрать те, в которых на этикетке будут значиться: пантенол, аллантоин, морской коллаген, гиалуроновая кислота, витамин Е, муцин улитки и другие.

Упражнения от брылей

Красивая и подтянутая кожа на любом участке тела немыслима без сильных мышц. Лицо не является исключением из правил. Рассмотрим специальный комплекс упражнений, позволяющий держать мышечные волокна в тонусе:

Фейсфитнес поможет продлить молодость и подтянуть нечеткие контуры лица. Достаточно уделять процедурам 15-30 минут в день. Хорошо совмещать их с массажем, лифтинг-масками и другими средствами ухода, улучшающими тургор.

Космецевтика

Симбиоз косметологических препаратов и нутрицевтики хорошо зарекомендовал себя в борьбе с косметическими дефектами. Такие составы оказывают как уходовый эффект, так и осуществляют оздоровительное действие на кожу. Редкие экстракты растений, запатентованные эффективные витаминные и белковые комплексы позволяют стимулировать синтез коллагена и эластина в тканях, восстанавливать водно-жировой баланс.

Косметика от корпорации RHANA содержит необходимые белки, витамины, микро- и макрокомпоненты, факторы роста, нужные для обновления и оздоровления клеток:

Как подтянуть брыли на лице хирургически

Самым эффективным, но и радикальным, методом исправления ситуации является хирургия. Стоит помнить, что любое вмешательство в организм человека сопровождается рисками. Поэтому прежде чем обращаться к хирургу, необходимо пройти полное обследование у лечащего врача.

На сегодняшний день есть малые щадящие методики, позволяющие вернуть тургор с минимальным вмешательством и повреждением тканей. Эти задачи должны быть первоочередными в решении проблем эстетической медицины.

Также врачи рекомендуют перед операцией обратиться в медицинское учреждение, чтобы найти первопричину опущения. Если, конечно, они не очевидны (лишний вес, генетика, возраст старше 50 лет). В этом случае можно гарантировать долговременный эффект после применения процедур.

Контурная пластика брылей

Один из самых простых методов, который хорошо зарекомендовал себя в плане борьбы с опущением кожи. Методика основывается на инъекциях специального геля или филлера в глубокие слои дермы. Проколы делаются на достаточной глубине, чтобы не образовывать видимых бугорков. В основе таких препаратов лежит гиалуроновая кислота. Она быстро всасывается клетками, но при этом стимулирует выработку коллагена и эластина в тканях, увлажняет, препятствует обезвоживанию. Данный способ относится к малоинвазивным и малотравматичным, поэтому может применяться даже без предварительной консультации с терапевтом. Составы в зависимости от бренда отличаются, однако в основном содержат:

Как видно, в составах нет ничего опасного, наоборот, все эти вещества необходимы для нормального функционирования клеток дермы, но часто их не хватает. Инвазивный метод позволяет сразу доставить вещества в большом количестве в глубокие слои дермы, запуская синтез коллагена, эластина и обновления клеточной структуры.

Источник

Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования

С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования

Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»

И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования

И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии

Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии

К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»

Введение

Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.

Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).

В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.

Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).

Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.

Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.

Материалы и методы

Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.

Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.

Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).

Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).

Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.

Результаты и обсуждение

В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).

Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже

По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).

Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа

Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа

Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.

Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.

Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.

В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.

Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).

Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.

Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.

На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.

Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия

Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).

Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)

Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)

Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).

Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4

Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4

Заключение

Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.

Источник